La prueba de la PCR. Su aplicación a los estudios de ADN dental

Actualmente estamos oyendo, de forma habitual, el término PCR, cuando se comentan las pruebas para determinar la presencia del SARS-CoV-2. Las siglas PCR pertenecen al nombre en inglés de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction). Esta prueba de laboratorio, utilizada para conocer la presencia del virus, se conoce en los laboratorios de genética forense desde 1983, cuando Kary Mullis ganó el Premio Nobel de Química, tras su descubrimiento. La Reacción en Cadena de la Polimerasa permite alargar diminutos fragmentos de ADN autosómico, para facilitar su estudio en identificación forense. Gracias a este procedimiento se analizan con facilidad muestras biológicas procedentes de tejidos humanos, donde existen células nucleadas. Cuando no se pueden utilizar otros procedimientos de identificación, el análisis de ADN resuelve la investigación de cadáveres fragmentados carbonizados o esqueletizados.

Autores: Dr. Juan López Palafox, Dra. Rosalía Vega Martínez y Rosangela Salerno.

Introducción

Desde el marzo de 2020, se está hablando continuamente del virus conocido como Covid19, definido en los estamentos científicos como “SARSCoV-2”, abreviatura en inglés de “Severe Scute Respiratory Syndrome” (síndrome respiratorio agudo grave; Covid 19).

Después de un año desde su aparición, continuamos preocupados por la expansión rápida y peligrosa de este virus mortífero.

La detección del virus en los primeros momentos es importante, para lograr la curación de las personas contagiadas y evitar su propagación.

El diagnóstico fiable se realiza mediante una prueba de laboratorio, que se ha hecho popular, conocida por sus iniciales: PCR.

Muchas personas se preguntan frecuentemente, qué es esa prueba y para qué sirve, cuál es su base científica. Todavía son muchos los que confunden el significado de esas siglas “PCR”. pensando que corresponde a la llamada “Proteína C reactiva”, que se nombra con las mismas siglas, una proteína producida por el hígado, que se envía al torrente sanguíneo en respuesta a una inflamación.

La prueba de PCR, referida a la Proteína C reactiva, se puede utilizar para detectar enfermedades que causan inflamación, por ejemplo: Infec
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ciones bacterianas, una sepsis generalizada, que pone en peligro la vida, una infección por hongos, enfermedad intestinal inflamatoria, que causa hinchazón y sangrado en los intestinos, un trastorno autoinmune, como lupus o artritis reumatoide, o también una osteomielitis.

Sin embargo, debemos recordar que al hablar de la prueba de la PCR para identificar el virus del Covid 19, estamos citando la Reacción en Cadena de la Polimerasa. Es la realización mediante técnicas de laboratorio, de una amplificación de la cadena de ADN, utilizando la enzima conocida como Polimerasa. Es una reacción multiplicadora que habitualmente y de forma natural, ocurre en las cadenas de ADN humana.

En el caso del Covid 19, se detecta el material genético del virus SARS-CoV-2 a partir de las muestras celulares, muy pequeñas, obtenidas de nuestro cuerpo.1

La reacción en cadena de la Polimerasa, se aplica en los laboratorios de genética desde los años 80, con fines identificativos. No es un procedimiento nuevo.

En nuestro trabajo, aprovechando la popularidad de la PCR, queremos recordar el interés de esta reacción, en la identificación de muestras biológicas con fines identificativos, y de forma muy especial, su aplicación habitual para muestras genéticas procedentes de cadáveres, que fueron obtenidas de tejidos ricos en células nucleadas, incluyendo los buco-dentales, cuando las condiciones no permitieron utilizar otros tejidos humanos.

Ya conocemos la dificultad que presentan los cadáveres calcinados o putrefactos para su identificación, al destruirse las muestras biológicas, lo mismo que ocurre frecuentemente en los cuerpos rescatados del mar. En estas circunstancias, únicamente son de utilidad los dientes por sus características morfológicas y estructurales.

En estas situaciones extremas, incluso las muestras dentales pueden estar degradadas, o ser muy pequeñas. La aplicación de la técnica de PCR, que actualmente todos conocen gracias a la publicidad de los test para identificar el virus SARSCoV-2, permiten analizar después de amplificar las muestras de ADN.

Como hemos explicado al principio de este apartado, la técnica no ha aparecido con el Covid. Los laboratorios de genética forense vienen utilizando de forma habitual, este procedimiento desde la década de los ochenta-noventa. En 1996 el Dr. López Palafox, publicaba un trabajo de tesis, identificando por técnicas de extracción y amplificación de ADN nuclear, 62 muestras dentales de cadáveres carbonizados. En 10 casos, estaban muy degradados y no se pudo hacer un estudio fiable, pero en el resto (un 77,4%), se logró obtener muestras para su identificación genética gracias a la aplicación de la PCR, paralelamente2.

Desde aquellas fechas hasta nuestros días, el procedimiento de amplificación mediante la técnica de la Polimerasa se ha venido utilizando de forma continuada en todos los laboratorios de criminalística de todo el mundo.

Breve historia del ADN

En el siglo XVII, Robert Hook, analizando con su microscopio un corte de corcho, notó que estaba formado por varias celdas. De ahí, unos años más tarde, Marcelo Malpighi, observó la primera célula viva y en el 1838 M. J. Schleiden afirmó que los seres vivientes estaban constituidos por células. Todo lo que se refiere a la genética empezó veinte años más tarde, gracias a Gregor Mendel y su estudio sobre los guisantes olorosos, demostrando que existían elementos hereditarios en cada organismo.

Al mismo tiempo, el químico suizo Friedrich Miescher, descubrió que en los núcleos de las células se encontraba una sustancia que en futuro se determinó como ácido nucleico y además se distinguieron dos tipos diferentes: ribosa y desoxirribosa. En el siglo XX, más precisamente en el 1944, fue Oswald T. Avery entre otros, el primero en confirmar que el ADN era el material genético en los seres humanos. Además el físico Max Delbruck introdujo el concepto de mutación genética3. En estas primeras décadas del 1900, los conocimientos sobre el ADN lo identificaban como una macromolécula compuesta por un grupo fosfato, un sacárido de cinco carbonos y una base nitrogenada4.

Superado los años 50, la química Rosalind Franklin empezó a trabajar en Londres, donde profundizó sus conocimientos sobre la cristalografía de rayos X, que resultarán fundamentales en el descubrimiento de la estructura del ADN5. El 25 abril de 1953, en la revista “Nature”, Watson y Crick publicaron el artículo “Estructura molecular de los ácidos nucleicos”, donde por primera vez hablaron de la estructura en doble hélice del Ácido Desoxirribonucleico6.

El Ácido Desoxirribonucleico

Se ha estimado que, un hombre joven, de setenta kilos, está compuesto por más o menos cien mil millones de células eucariotas. Cada célula, limitada por su membrana plasmática, a la vez contiene en su interior, flotando en el citoplasma, un montón de orgánulos cada uno con su función específica.

El modelo tridimensional que construyeron Watson y Crick con hilo metálico y cartón para representar una molécula de ADN mantiene su validez hasta hoy en día.

La unidad básica del esqueleto de la doble hélice, se llama nucleótido y está compuesto por un azúcar y una base nitrogenada (nucleósido) más un fosfato.

El azúcar es una pentosa en forma de β-furanosa, hablamos de ribosa en el caso del ARN y de desoxirribosa por el ADN y los dos azucares se diferencian porque la del ADN ha perdido un grupo hidroxilo en el segundo carbono. Las bases nitrogenadas derivan o da la pirimidina (Citocina y Timina) o da la purina (Adenina y Guanina).

El fosfato (PO₄³⁻) se une al quinto carbono (C5’) del azúcar con un enlace fosfoester (mononucleótido). El mononucleótido pasa a ser polinucleótido al unirse, siempre por un enlace fosfoester, al grupo hidroxilo del tercer carbón (3C’) del azúcar siguiente y así se compone una cadena de nucleótidos que determinan la estructura primaria de las hebras de la doble hélice7.

La estructura secundaria del Ácido Desoxirribonucleico es la disposición que tienen los nucleótidos en el espacio y entre ellos.

Las bases se sitúan en el interior y los nucleósidos hacia fuera, marcando una polaridad externa y un fuerte carácter apolar internamente, además, las dos hebras están unidas por puentes de hidrogeno entre las bases, de forma complementaria y antiparalela.

Son complementaria porque las bases de Adenina se unen a las de Timina y las de Guanina con las de Citocina, presentando 10 pares de bases por vuelta. Antiparalelas porque la unión aviene entre el grupo hidroxilo del C3’ del nucleótido de una hebra y el fosfato del C5’ de la otra, así que las dos extremidades serán 3’-5’ y 3’-5’- 8.

Importancia del ADN en identificación personal

Ya, en 1985, Jeffreys, logró obtener un patrón de bandas (en la misma forma que aparecen las marcas de un producto comercial), que demostró que era única e irrepetible para cada individuo. Desde entonces, hasta nuestros días se ha venido hablando de “huella genética”, por sus características similares a las huellas dactilares, que hasta ese momento eran el único procedimiento totalmente individualizador para identificar a una persona9.

Estos patrones de bandas, se obtuvieron al cortar las cadenas de ADN en puntos específicos, procediendo después a separar los fragmentos, dependiendo de su tamaño. Los resultados obtenidos utilizando muestras de sangre o tejidos frescos eran buenos, pero surgieron problemas, cuando las muestras eran escasas, o el ADN no estaba íntegro, en cantidades insuficientes para su estudio.

Queremos recordar las técnicas de estudio del ADN en identificación y de forma especial, la utilidad de la aplicación de la PCR para el estudio de muestras aparentemente insuficientes.

Recordemos que el ADN humano es muy grande, el número de pares de bases o nucleótidos que lo forman es de aproximadamente 3000 millones. Sin embargo, no todos estos pares de bases tienen una función específica. Podemos clasificar al ADN según su función, en tres grupos completamente diferentes:

1. ADN codificante que se traduce en proteínas. Es el responsable de la formación de proteínas, puesto que tiene la información necesaria para formar la secuencia de aminoácidos de cada proteína. Este tipo de ADN que forma los genes estructurales y se le ha llamado ADN informativo. Del total del genoma humano, se considera que tan solo el 1-2 % codifica para proteínas.

2. ADN auxiliar que participa en la formación de proteínas pero no es responsable directo del orden de aminoácidos de la proteína. Suele tener diversas funciones: a) reguladora de la transcripción, es decir, contiene la información para que se forme una proteína (activación) o para que se paralice su formación (desactivación). b) mantenimiento de la integridad estructural del cromosoma. c) migración de los cromosomas durante la división celular.

3. ADN no funcional, que no se traduce a proteínas. Se creía que carecía de función alguna y por eso se la ha llamado ADN basura, pero se ha demostrado que su función es el mantenimiento de la arquitectura de los cromosomas (Puertas, 1991)10.

Las investigaciones genéticas, realizadas desde la década de los años 70-80, especialmente, demostraron la existencia de tramos más o menos cortos de ADN humano, que se diferenciaban de unas a otras personas. Existían zonas concretas en las que el ADN variaba en la secuencia o el orden de las bases nitrogenadas. Es decir, que presentaban variaciones genéticas. Se descubrió que el ADN no codificante no está sujeto a presiones selectivas, con variaciones muy grandes. Esas regiones demostraron su importancia para la identificación personal de forma individualizada11.

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También puede consultar el número 61 de DM El Dentista Moderno